ÿþVor dem Hintergrund einer früheren Studie puma basket heart white [25], in der gezeigt wurde, dass ErbB4 mit Bcl-2 interagiert und dass EGFR / EGFRvIII und ErbB4 eine strukturelle Homologie aufweisen, untersuchten wir, ob EGFR / EGFRvIII mit den drei proapoptotischen Proteinen, die mit Bcl-2 koexprimieren, einen Komplex bildet Rezeptoren. Wie aus den Ergebnissen der Immunpräzipitation (IP) / Western-Blotting unter Verwendung eines EGFR-Antikörpers für IP (1c) hervorgeht, bildet EGFRvIII in GBM-Xenotransplantaten mit endogenem EGFRvIII (D-270 MG) einen Komplex mit PUMA, jedoch nicht mit Bax und Bmf und D-317 MG) und mit stabil transfiziertem EGFRvIII (U87MGEGFRvIII). In ähnlicher Weise wurde gezeigt, dass PUMA in drei EGFR-exprimierenden GBM-Zelllinien mit EGFR coimmunopräzipitiert (1d).

Um zu untersuchen, ob PUMA für die Induktion von Apoptose in GBM essentiell ist, wurde PUMA-spezifische siRNA verwendet, um die PUMA-Expression und die Reaktion von U87MG-GBM-Zellen, die sehr niedrige EGFR-Spiegel exprimieren, auf Anisomycin, einen potenten Induktor von, herunter zu regulieren Apoptose [38] puma basket lack wurde untersucht. Wie in 3a gezeigt, zeigte der TUNEL-Assay, dass PUMA Knockdown U87MG-Zellen resistent gegen Apoptose (2,5%) macht, induziert durch 48-stündige Anisomycin-Behandlungen. Im Gegensatz dazu erfahren mit der Kontroll-siRNA transfizierte U87MG-Zellen eine signifikante Anisomycin-induzierte Apoptose (45,5%). In dem Assay repräsentieren die gelben fusionierten Signale nuklear fragmentierte DNA.

Wie erwartet zeigten puma basket platform beige unbehandelte Zellen keinen Hinweis auf Apoptose (Daten nicht gezeigt). Das Western Blot (3b) zeigte, dass die PUMA-Expression durch die PUMA-spezifische siRNA spezifisch und effizient herunterreguliert wurde. Auswirkungen der Herunterregulierung der PUMA-Expression und der erhöhten EGFRvIII-Expression auf die Induktion von Apoptose in GBM-Zellen. Das Ausmaß der Apoptose wird wie folgt berechnet: (Anzahl der apoptotischen Kerne) / (Gesamtanzahl der Kerne). In beiden Panels wurden 250-300 Zellen in jedem Experiment untersucht und drei unabhängige Experimente wurden durchgeführt, um Mittelwerte und Standardabweichungen abzuleiten. (A) PUMA-Expressions-Knockdown macht GBM-Zellen resistent gegen Apoptose, wie durch den TUNEL-Assay angezeigt.

Nach der Behandlung mit Anisomycin gab es nur puma basket platform core 3,1% Apoptose in U87MG-EGFRvIII-Zellen. Im Gegensatz dazu zeigten die isogenen U87MG-Vektorzellen mit niedrigem EGFR-Gehalt eine massive Apoptose (49,8%), ähnlich wie bei der PUMA-Herunterregulierung (45,5%). Die Ergebnisse in 3 zeigen zusammengenommen, dass die GBM-Apoptose durch PUMA positiv reguliert und durch EGFR / EGFRvIII negativ beeinflusst wird, was darauf hindeutet, dass die PUMA- und EGFR / EGFRvIII-Pfade funktionell aber umgekehrt mit der Apoptose in GBM-Zellen verbunden sind. 4 zeigen, dass in GBM-Zellen EGFR / EGFRvIII und PUMA unter nicht belasteten Bedingungen einen Komplex bilden und dass der Komplex auch nach der Behandlung mit dem Apoptose-Induktor Staurosporin (ST) erhalten bleibt.

Das Fehlen von ±-Tubulin und Cox IV in den mitochondrialen bzw. nicht mitochondrialen Fraktionen zeigte die Wirksamkeit der Fraktionierung an. Niedrige mtPUMA-Indizes deuten darauf hin, dass PUMA hauptsächlich im Zytoplasma von U87MG-EGFRvIII-Zellen unter ungestressten und gestressten Bedingungen lokalisiert ist. (B) PUMA ist ausschließlich in den mitochondrialen Fraktionen von U87MG-Vektorzellen lokalisiert. U87MG-Vektorzellen wurden behandelt, fraktioniert und Proteine   analysiert, wie zuvor in Panel a beschrieben. Die mtPUMA-Indizes in diesen Zellen sind 1,0, was darauf hinweist, dass PUMA unabhängig von apoptotischem Stress ausschließlich in den Mitochondrien dieser Zellen nachgewiesen wird. (C) Der Abbau der EGFR-Expression durch siRNA führt puma basket platform metallic zu einer erhöhten mitochondrialen Translokalisierung von PUMA.

PUMA ist hauptsächlich im Zytoplasma dieser Zellen unter unbelasteten und gestressten Bedingungen lokalisiert, was durch die niedrigen mtPUMA-Indizes angezeigt wird. Ähnliche Beobachtungen wurden auch in T98G-GBM-Zellen gefunden, die auf natürliche Weise EGFR exprimieren (5c). Der bescheidene Nachweis von mitochondrialem PUMA in diesen Zellen kann möglicherweise das Ergebnis einer unzureichenden zytoplasmatischen EGFR sein, um mit allen PUMA-Molekülen im Zytoplasma zu interagieren und diese zu sequestrieren. Wichtig ist, dass der siRNA-vermittelte Abbau der EGFR-Expression zu einem signifikanten Anstieg (16-fach) des mitochondrialen PUMA führte (Abb. 5c-links), was weiter darauf hindeutet, dass EGFR die mitochondriale PUMA-Translokalisierung modulieren kann.