ÿþLa actividad de la peroxidasa endógena puma el corte ingles se bloqueó con peróxido de hidrógeno al 0,3% y los portaobjetos se incubaron con suero de cabra normal al 10% durante 30 minutos y luego con anticuerpo monoclonal de ratón anti-EGFR (1:50; Novocastra RTU-EGFR-384) y policlonal de conejo anti-PUMA anticuerpo (1: 100; Señalización celular) a 4 ° C durante la noche. Después de lavados con PBS, los portaobjetos se incubaron con anticuerpos secundarios biotinilados y luego con complejo de avidina-biotina-peroxidasa de rábano picante. La detección se realizó utilizando 0,125% de cromógeno de aminoetilcarbazol. Después de la contratinción con la hematoxilina de Mayer (Sigma), se montaron los lados.

En estos estudios, sometimos el 25% de las proteínas mitocondriales y el 2.5% de las proteínas no mitocondriales a la transferencia Western. Las señales de banda de PUMA mitocondrial y PUMA no mitocondrial se determinaron densitómicamente usando el software NIH ImageJ, como describimos previamente [31]. Posteriormente, se calculó el alcance de la translocalización mitocondrial PUMA, designada como índice mtPUMA, utilizando la puma suede platform ecuación a continuación. Examinamos un panel de ocho GBM y dos líneas celulares AA para la expresión de EGFR / EGFRvIII y miembros proapoptóticos de la familia de proteínas Bcl-2 . Como se muestra en la Fig. 1a, la mayoría de estas líneas celulares coexpresan altos niveles de EGFR y tres proteínas proapoptóticas, a puma creepers saber, PUMA, Bax y Bmf.

EGFR y EGFRvIII coexpresan paradójicamente con proteínas proapoptóticas e interactúan específicamente con PUMA en GBM. (A) Expresión de EGFR y proteínas proapoptóticas en líneas celulares de glioma maligno humano. Los extractos celulares totales aislados de ocho GBM y dos líneas celulares AA se sometieron a transferencia Western para determinar los niveles de la familia de proteínas proapoptóticas EGFR y Bcl-2, incluyendo Bad, PUMA, Bax, Bim, Bmf y Bok. La ±-tubulina se determinó como controles de carga. Líneas celulares: 1, UW14; 2, UW281; 3, MGR1; 4, MGR2; 5, MGR3; 6, T98G; 7, U373MG; 8, UW5; 9, UW15; 10, UW19.

Usando una cohorte de 101 gliomas y 12 puma ignite limitless tejidos cerebrales normales, examinamos los niveles de EGFR / EGFRvIII y PUMA a través de IHC. Los resultados indican una correlación positiva significativa entre los niveles de expresión de EGFR / EGFRvIII y PUMA (p = 0.039). Como se muestra en la Fig. 2a, el grado de coexpresión de EGFR / EGFRvIII-PUMA es significativamente mayor en los gliomas malignos de alto grado (20% en AA y 34.1% en GBM) que en los gliomas de bajo grado (6.3-7.7% ) y tejidos cerebrales normales (0%). El análisis de regresión indica además que EGFR solo, PUMA solo y la coexpresión EGFR / PUMA se correlacionan significativamente con el grado de glioma (Fig. 2a).

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